PCR实验室污染源控制及防污染措施方法

PCR实验是基于核酸水平的微观样本实验，而这些微观样本对温度、ph值等实验环境非常敏感，在尽力维护样本的保存环境的同时，核酸样本污染也成为不可避免的话题。“易查不易察”，污染来的悄无声息，今天给大家简单介绍一下PCR实验室的主要污染来源、实验中如何避免和减少污染的可能性及实验发生污染的应急处理方案。

PCR实验室的污染来源

样本间交叉污染：

收集样本的容器被污染或样本密封不严外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。

实验试剂污染：

在试剂配制过程中，掺入核酸模板导致污染。

扩增产物污染：

大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖。

克隆质粒污染：

作为阳性质控品的克隆质粒外溢。

PCR实验室的防污染方法

合理的实验室分区：

试剂准备区、样本制备区和扩增区内的实验用品，包括移液器等器具应专用，空气、物品流向依次为：试剂准备区、样本制备区、扩增区、产物分析区，不可逆行。

清洁的实验用品：

实验室自配试剂（去离子水、缓冲液等）和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌。枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。

正确的实验操作：

• 实验应在超净工作台内进行，工作台内应放置PCR专用的微量离心机、各量程的移液器和其他必须物品。
• 实验的过程中选择最合适尺寸的手套并能及时更换，在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套，以避免不同实验区交叉污染。
• 装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体离至管底，降低污染手套或加样器的风险；谨慎开启反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。
• 吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行，遵守“慢吸快打”原则，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以避免气溶胶产生的交叉污染。
• PCR试剂建议小量分装，以减少反复冻融、重复取样次数；多样本PCR反应时，先配制反应混合液分装至反应管中，最后加入样本核酸，请勿同时开盖，尽量保证单人单管，实现完全闭管操作。
• 实验试剂应与样品和PCR产物分开保存，不应放于同处。
• PCR扩增实验完成后及时将反应管取出，用一次性手套将产物反应管包裹丢弃，保证管盖紧闭。

规范的实验设计：

应遵循实验室内部质量控制的相关规定，实验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照，全程质控实验过程，验证PCR反应的可靠性，并协助判断扩增系统的可信性。

PCR实验室的污染应急处理方法

若核酸样本溢出：

立即用布或纸巾覆盖，由外围向中心倾倒10%的次氯酸消毒剂，约30分钟后，清除污染物品，再用次氯酸消毒剂擦拭，并用75%酒精喷洒，移动紫外车定点照射1小时。

其他不明情况污染：

1、暂停所有实验操作；

2、清理实验室内所有物品，寻找污染来源；

3、加大实验室的通风；

4、对实验室内所有表面（台面、地面及墙面） 进行消毒；

5、75%酒精空中喷雾；

6、开启紫外消毒装置，延长紫外照射时间（4小 时以上）；

7、以上措施每日进行，直至污染消除；用新试剂及确认无污染的器材进行原污染项目的试剂空白检测，连续3次均阴性后方可进行常规检测。

参考文献
[1] 黄启慧. 实时定量PCR实验室管理及污染预防[J]. 内蒙古中医药, 2012(4):62-62.

[2] 李金明. 实时荧光PCR技术[M]. 第2版. 北京: 科学出版社,2018.