微生物检验实验室操作技术要求

微生物检验实验室操作技术要求

第一节 实验室管理制度

一、实验室管理制度

1.实验室应制定仪器配备管理、使用制度,药品管理、使用制度,玻璃器皿管理、使用制度,并根据安全制度和环境条件的要求,本室工作人员应严格掌握,认真执行。2.进入实验室必须穿工作服,进入无菌室换无菌衣、帽、鞋,戴好口罩,非实验室人员不得进入实验室,严格执行安全操作规程。

3.实验室内物品摆放整齐,试剂定期检查并有明晰标签,仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。

4.各种器材应建立请领消耗记录,贵重仪器有使用记录,破损遗失应填写报告;药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让,更不得私自拿出。5.禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗,实验室内不得带入私人物品,离开实验室前认真检查水电,对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。

6.负责人严格执行本制度,出现问题立即报告,造成病原扩散等责任事故者,应视情节直至追究法律责任。

二、仪器配备、管理使用制度

1.食品微生物实验室应具备下列仪器:培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱,电位 pH计、高速离心机。

2.实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求,保证准确可靠,凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。

3.实验室仪器安放合理,贵重仪器有专人保管,建立仪器档案,并备有操作方法,保养、维修、说明书及使用登记本,做到经常维护、保养和检查,精密仪器不得随意移动,若有损坏需要修理时,不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员,由经理同意填报修理申请、送仪器维修部门。

4.各种仪器(冰箱、温箱除外),使用完毕后要立即切断电源,旋钮复原归位,待仔细检查后,方可离去。5.一切仪器设备未经设备管理人员同意,不得外借,使用后按登记本的内容进行登记。

6.仪器设备应保持清洁,一般应有仪器套罩。

7.使用仪器时,应严格按操作规程进行,对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏,要追究当事者责任。

三、药品管理、使用制度1.依据本室检测任务,制定各种药品试剂采购计划,写清品名、单位、数量、纯度、包装规格,出厂日期等,领回后建立账目,专人管理,每半年做出消耗表,并清点剩余药品。2.药品试剂陈列整齐,放置有序、避光、防潮、通风干燥,瓶签完整,剧毒药品加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。

3.领用药品试剂,需填写请领单、由使用人和室负责人签字,任何人无权私自出借或馈送药品试剂,本单位科、室间或外单位互借时需经科室负责人签字。

4.称取药品试剂应按操作规范进行,用后盖好,必要时可封口或黑纸包裹,不使用过期或变质药品。

四、玻璃器皿管理、使用制度1.根据测试项目的要求,申报玻璃仪器的采购计划、详细注明规格、产地、数量、要求,硬质中性玻璃仪器应经计量验证合格。2.大型器皿建立账目,每年清查一次,一般低值易耗器皿损坏后随时填写损耗登记清单。

3.玻璃器皿使用前应除去污垢,并用清洁液或2%稀盐酸溶液浸泡24 h后,用清水冲洗干净备用。

4.器皿使用后随时清洗,染菌后应严格高压灭菌,不得乱弃乱扔。

五、安全制度

1.进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。2.在进行高压、干燥、消毒等工作时,工作人员不得擅自离现场,认真观察温度、时间,蒸馏易挥发、易燃液体时,不准直接加热,应置水浴锅上进行,试验过程中如产生毒气时应在避毒柜内操作。3.严禁用口直接吸取药品和菌液,按无菌操作进行,如发生菌液、病原体溅出容器外时,应立即用有效消毒剂进行彻底消毒,安全处理后方可离开现场。

4.工作完毕,两手用清水肥皂洗净,必要时可用新洁尔灭、过氧乙酸泡手,然后用水冲洗,工作服应经常清洗,保持整洁,必要时高压消毒。

5.实验完毕,即时清理现场和实验用具,对染菌带毒物品,进行消毒灭菌处理。6.每日下班,尤其节假日前后认真检查水、电和正在使用的仪器设备,关好门窗,方可离去。

六、环境条件要求1.实验室内要经常保持清洁卫生,每天上下班应进行清扫整理,桌柜等表面应每天用消毒液擦拭,保持无尘,杜绝污染。2.实验室应井然有序,不得存放实验室外及个人物品、仪器等,实验室用品要摆放合理,并有固定位置。

3.随时保持实验室卫生,不得乱扔纸屑等杂物,测试用过的废弃物要倒在固定的箱筒内,并及时处理。

4.实验室应具有优良的采光条件和照明设备。

5.实验室工作台面应保持水平和无渗漏,墙壁和地面应当光滑和容易清洗。

6.实验室布局要合理,一般实验室应有准备间和无菌室,无菌室应有良好的通风条件,如安装空调设备及过滤设备,无菌室内空气测试应基本达到无菌。

7.严禁利用实验室作会议室及其他文娱活动和学习场所。

第二节 实验室技术操作要求

一、无菌操作要求

食品微生物实验室工作人员,必须有严格的无菌观念,许多试验要求在无菌条件下进行,主要原因:一是防止试验操作中人为污染样品,二是保证工作人员安全,防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。

1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2.进行接种食品样品时,必须穿专用的工作服、帽及拖鞋,应放在无菌室缓冲间,工作前经紫外线消毒后使用。

3.接种食品样品时,应在进无菌室前用肥皂洗手,然后用75%酒精棉球将手擦干净。

4.进行接种所用的吸管,平皿及培养基等必须经消毒灭菌,打开包装未使用完的器皿,不能放置后再使用,金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

5.从包装中取出吸管时,吸管尖部不能触及外露部位,使用吸管接种于试管或平皿时,吸管尖不得触及试管或平皿边。

6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作,接种细菌或样品时,吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。

7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝,必要时还要烧到环和针与杆的连接处,接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min,再经火焰烧灼。

8.吸管吸取菌液或样品时,应用相应的橡皮头吸取,不得直接用口吸。

二、无菌间使用要求

1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃,并要密封,不得随意打开,并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门,另设有0.5-0.7m2的小窗,以备进入无菌间后传递物品。2.无菌间内应保持清洁,工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒,擦拭工作台面,不得存放与实验无关的物品。

3.无菌间使用前后应将门关紧,打开紫外灯,如采用室内悬吊紫外灯消毒时,需30W紫外灯,距离在1.0m处,照射时间不少于30min,使用紫外灯,应注意不得直接在紫外线下操作,以免引起损伤,灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭,除去上面灰尘和油垢,以减少紫外线穿透的影响。

4.处理和接种食品标本时,进入无菌间操作,不得随意出入,如需要传递物品,可通过小窗传递。

5.在无菌间内如需要安装空调时,则应有过滤装置。

三、消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等,必须经灭菌后方能使用。

(一)干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法

1.灭菌前准备 (1)所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密,如用金属筒应将上面通气孔打开。(2)装培养基的三角瓶塞,用纸包好,试管盖好盖,注射器须将管芯抽出,用纱布包好。

2.装放(1)干热灭菌器:装放物品不可过挤,且不能接触箱的四壁。(2)大型高压蒸气锅:放置灭菌物品分别包扎好,直接放入消毒筒内,物品之间不能过挤

3.设备检查 (1)检查门的开关是否灵活,橡皮圈有无损坏,是否平整。(2)检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位,关好门和盖,通蒸气或加热后,观察是否漏气,压力表与温度计所标示的状况是否吻合,管道有无堵塞。(3)对有自动电子程序控制装置的灭菌器,使用前应检查规定的程序,是否符合于进行灭菌处理的要求。

4.灭菌处理 (1) 干热灭菌法:此法适应于在干热情况下,不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。

a.器械器皿应清洗后再干烤,以防附着在表面的污物炭化。

b.灭菌时安放物品不能过挤,不要直接接触底和箱壁,物品之间留有空隙。

c.菌时将箱门关紧,接上电源,先将排气孔打开约30min,排除灭菌器中的冷空气,温度升至160℃调节指示灯,维持1.5 –2h。d.灭菌完毕后或温度升温过程中,须在60℃以下才能打开箱门。(2) 手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行:

a.手提式高压锅在主体内加入3L清水,立式高压锅加水16L(重复使用时应将水量补足,水变混浊需更换).

b.手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中(无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用)。c.盖好顶盖拧紧,勿使漏气;置灭菌器于火源上加热,立式压力锅通上电源,并打开顶盖上的排气阀放了冷气(水沸腾后排气10-15min)。

d.关闭排气阀,使蒸气压上升到规定要求,并维持规定时间(按灭菌物品性质与有

关情况而定)。e.达到规定时间后,对需干燥的物品,立即打开排气阀排出蒸气,待压力恢复到零时,自然冷却至60℃后开盖取物,如为液体物品,不要打开排气阀,而应立即将锅去除热源,待自然冷却,压力恢复至零,温度降到60℃以下再开盖取物,以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。(3) 卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行:a.关紧锅门,打开进气阀,将蒸气引入夹层进行预热,夹层内冷空气经阻气器自动排出。

b.夹层达到预定温度后,打开锅室进气阀,将蒸气引入锅室,锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。c.待锅室达到规定的压力与温度时,调节进气阀,使保持恒定至 d.自然或人工降温至60℃再开门取物,不得使用快速排出蒸气法,以防突然降压,液体剧烈沸腾或容器爆破。

e.使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器,在放好物品关紧门后,应根据物品类别按动相应开关,以便按要求程序自动进行灭菌,灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查,操作要求应严格按照厂家说明书进行。

5.灭菌温度与时间 (1) 干热灭菌器灭菌温度160℃,1.5-2h。

(2) 压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见表1。

(二)间歇灭菌方法

1.灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌,某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏,可用此法灭菌。

(1)将欲灭菌物品置于锅内,盖上顶盖,打开排水口,使器内余水排尽。(2)关闭排水口,打开进气门,根据需要消毒10~20min。

(3)灭菌完毕关闭进气门,取出物品待冷至室温温度,放入37℃温箱过夜,次日仍按上述方法消毒,如此三次,即可达到灭菌目的。

2.血清凝固器使用方法,培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时,因高热会破坏其营养成份,故用低温,可使血清凝固,又可达到灭菌目的。

(1) 在使用该法灭菌的血清等分装时,需严格遵守无菌操作,试管、平皿也经灭菌后使用。

(2)将培养基按要求使成斜面或高层,加足水后,接上电源,升温75~90℃1h灭菌,放37℃温箱过夜,再如此灭菌三次。

3.煮沸消毒:可用煮锅或煮沸消毒器,水沸腾后再煮5~15 min,也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5 min,加入0.02﹪甲醛, 80℃煮60 min均可达到灭菌目的, 但选用煮沸消毒的增消剂时, 应注意对物品的腐蚀性.

4.灭菌处理:灭菌后物品,按正常情况已属无菌,从灭菌器中取出应仔细检查放置,以免再度污染。

(1) 物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉,不可作为无菌物品使用。

(2) 取出的物品,如为包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。(3) 培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。

(4) 启闭式容器,在取出时应将筛孔关闭。(5) 取出的物品掉落在地或误放不洁这处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。(6) 取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。

(7) 凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。(8) 每批灭菌处理完成后,记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。

四、有毒有菌污物处理要求

微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理,一律不得带出实验室。

1. 经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内,并集中存放在指定地点,待统一进行高压灭菌。

2. 经微生物污染的培养物,必须经121℃30min高压灭菌。3. 染菌后的吸管,使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中,最少浸泡24h(消毒液体不得低于浸泡的高度)再经121℃30 min高压灭菌。

4. 涂片染色冲洗片的液体,一般可直接冲入下水道,烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中,经高压灭菌后方可倒入下水道,染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后,煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿,必须高压灭菌后洗涤。

5. 打碎的培养物,立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位,浸泡半小时后再擦拭干净。

污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等,应放入专用消毒袋内,经高压灭菌后方能洗涤。

五、培养基制备要求

基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同,培养目的的不同,各种培养基制备要求如下:

1.根据培养基配方的成分按量称取,然后溶于蒸馏水中,在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。

2.PH测定及调节:PH测定要在培养基冷至室温时进行,因在热或冷的情况下,其PH有一定差异,当测定好时,按计算量加入碱或酸混匀后,应再测试一次。培养基PH值一定要准确,否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高,故不宜灭菌压力过高或次数太多,以免影响培养基的质量,指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。

3.培养基需保持澄清,便于观察细菌的生长情况,培养基加热煮沸后,可用脱脂棉花或绒布过滤,以除去沉淀物,必要时可用鸡蛋白澄清处理,所用琼脂条要预先洗净晾干后使用,避免因琼脂含杂质而影响透明度。

4.盛装培养基不宜用铁、铜等容器,使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。

5.培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的,又要注意不因加热而降低其营养价值,一般121℃15min即可,如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等,则应采用低温灭菌或间歇法灭菌,一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等,待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。

6.每批培养基制备好后,应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基,使用标准菌株接种培养,观察生化反应结果,应呈正常反应,培养基不应贮存过久,必要时可置4℃冰箱存放。

7.目前各种干燥培养基较多,每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察,各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用,新购进的或存放过久的干燥培养基,在配制时也应测PH,使用时需根据产品说明书用量和方法进行。

8.每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录,以备查询。

六、样品采集及处理要求

1.所采集的检验样品一定要具有代表性,采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查,检查是否有污染源存在。

2.根据食品的种类及数量,采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。

3.采样应注意无菌操作,容器必须灭菌,避免环境中微生物污染,容器不得使用煤酚皂溶液,用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌,更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物,以避免杀死样品中的微生物,所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。

4.样品采集后应立即送往检验室进行检验,送检过程中一般不超过3h,如路程较远,可保存在1~5℃环境中,如需冷冻者,则在冻存状态下送检。

5.检验室收到样品后,进行登记(样品名称、送检单位、数量、日期、编号等),观察样品的外观,如果发现有下列情况之一者,可拒绝检验。

(1) 样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者,失去代表原食品检验意义者。

(2) 瓶、袋装食品已启开者,熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者,即失去原食品形状者(食物中毒样品除外)。

(3) 按规定采样数量不足者。

对送检符合要求的样品,检验室收到后,应立即进行检验,如果条件不具备,应置4℃冰箱存放,及时准备创造条件,然后进行检验。

6.样品检验时,根据其不同性状,进行适当处理。

(1) 液体样品接种时,应充分混合均匀,按量吸取进行接种。

(2) 固体样品,用灭菌刀、剪取其不同部位共25g,置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中,用均质器搅碎混匀后,按量吸取接种。

(3) 瓶、袋装食品应用灭菌操作启开,根据性状选择上述方法处理后接种。

七、样品检验、记录和报告的要求

1.检验室收到样品后,首先进行外观检验,及时按照国家标准检验方法进行检验,检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作,避免环境中微生物污染。

2.样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录,以作为对结果分析、判定的依据,记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。